В данной статье для нарративного обзора отобрано 7 оригинальных исследований, опубликованных в 2012–2024 годах, в которых отражены работы коллективов из Китая, США, Мексики, а также международные совместные проекты. Основное внимание уделено данным по материалам и клеточным культурам in vitro; в отдельных работах также представлены исследования на животных, однако клеточные эксперименты с использованием клеток человека в данной статье не трактуются как клинические данные об эффективности.
01Основа для культивирования клеток и трёхмерные каркасы: сначала определите, что именно необходимо наблюдать
При разработке материалов для культивирования клеток прежде всего следует определить экспериментальную задачу: требуется ли улучшить начальное прикрепление, наблюдать ориентацию и миграцию или обеспечить проникновение клеток в структуру определённой толщины и отложение ими матрикса? Эти цели соответствуют различным требованиям к пористости, опоре и поверхности. Результаты обычного двумерного культивирования и распределение клеток в трёхмерном каркасе следует оценивать раздельно; нельзя утверждать, что трёхмерное культивирование достигнуто только на основании того, что каркас имеет толщину.3,4,5,6
| Требования к культивированию | Волоконные структуры, подлежащие обсуждению | Основные объекты наблюдения |
|---|---|---|
| Двумерное культивирование и отбор материалов | Случайно ориентированные волоконные мембраны, модифицированные поверхности мембран | Адгезия, жизнеспособность, распространение и целевой фенотип клеток 1,2 |
| Ориентированные клетки и тканевая матрица | Композитная структура из ориентированных волокон и удаляемых компонентов | Направление ориентации, смачивание и распределение матрицы 5 |
| Трехмерное культивирование клеток | Многомасштабные волокна, сетки прямого письма и объемные каркасы | Внутреннее распределение клеток, соединенность пор и сохранение формы 3,4,6 |
«Универсальный тканевый каркас» здесь обозначает платформу материалов, которую можно адаптировать под различные типы клеток и экспериментальные цели; это не означает, что один состав подходит для всех тканей. Исследователям по-прежнему необходимо указывать источник клеток, условия культивирования, продолжительность культивирования, а также функции, которые предполагается сохранить или индуцировать.1,2,3,4,5,6,7
02От материала до структуры пор: какие переменные можно регулировать с помощью электроформования
С помощью электроформования можно получать волокна из синтетических полимеров в сочетании с белками и другими компонентами; также можно сначала изготовить каркас, а затем провести поверхностную иммобилизацию или последующую обработку. Смешивание изменяет не только состав, но может одновременно влиять на состояние раствора, размер волокон и смачиваемость. Поэтому при сравнении двух составов структурные изменения следует анализировать совместно с результатами культивирования клеток.1,2,3,7
В структурном аспекте можно обсуждать толщину волокон, их случайное или упорядоченное расположение, сосуществование волокон разных масштабов, а также послойное наложение сеток. Более тонкие волокна способствуют формированию обширных контактных поверхностей, однако плотная упаковка может ограничивать проникновение клеток внутрь. При проектировании каркаса необходимо найти сочетание площади контакта, пористости, опоры и клеточного поведения, подходящее для конкретного проекта.3,4,5
03Поверхность адгезии клеток: смешивание с белками и последующая модификация коллагена
Смешивание кератина из овечьей шерсти с PCL
В работе Wu и др. 2018 из овечьей шерсти был извлечен регенерированный кератин, который смешивали с PCL и подвергали электроформованию, после чего сравнивали смачиваемость, деградацию и результаты культивирования клеток при различных соотношениях компонентов. Эксперимент с фибробластами мыши в течение 7 дней показал, что системы с содержанием кератина улучшают адгезию и жизнеспособность клеток. Это свидетельствует о том, что природные белки могут выступать в качестве компонентов, регулирующих контактную поверхность синтетических полимеров, не выполняя при этом самостоятельно функции волокнообразования и несущей поддержки.1
Результаты данного исследования получены при использовании конкретного способа обработки кератина, системы PCL и клеточной модели. После изменения источника сырья или процесса экстракции волокнообразующие свойства и клеточные характеристики состава необходимо проверять заново; нельзя напрямую приравнивать «природное происхождение» к хорошей совместимости при любых условиях применения.1
Сначала формируют каркас из PVA, затем присоединяют коллаген
В исследовании мексиканской группы Pérez-Nava и др. 2023 был выбран иной подход: сначала изготовили нановолокна поливинилового спирта (PVA), а затем путем последующей реакции иммобилизовали коллаген на их поверхности. Исследование, объединившее химическую характеризацию, механические свойства в сухом и влажном состояниях и культивирование клеток HEK-293, показало улучшение биосовместимости после функционализации поверхности. Это демонстрирует, что биологические компоненты не обязательно должны проходить через тот же растворитель и процесс волокнообразования, что и полимер: их можно вводить уже после формирования каркаса.2
Для разработки образцов это означает, что вопросы «как стабилизировать формирование мембраны» и «с какой поверхностью контактируют клетки» можно разделить на две переменные, которые можно сравнивать независимо. При последующей модификации также следует отслеживать степень связывания, а также сохранение структуры после промывки и во влажном состоянии, чтобы не делать вывод о формировании стабильного функционального слоя лишь на основании добавления коллагена в раствор.2
04Обеспечение проникновения клеток внутрь: многомасштабные волокна, прямое письмо и удаляемые компоненты
Микроволокна создают пространство, нановолокна обеспечивают контакт
В работе Li и др. 2016 применялось безигольное дисковое электроформование для сравнения наноструктуры из PCL/ желатина со многомасштабной структурой микронаноуровня. Многомасштабные каркасы обладали большей пористостью, а культивирование фибробластов мыши и стромальных клеток костного мозга крысы показало улучшение пролиферации и проникновения внутрь. В исследовании четко разграничены понятия «однородность волокон» и «подходящая структура для культивирования»: не во всех задачах требуется получение полностью одинаковых тонких волокон.3
Расположение пор с помощью ближнего прямого письма
В работе He и др. 2018 для построения каркаса из PCL/ гидроксиапатита использовалось ближнее электроформование с прямым письмом и послойным наложением; сообщалось, что средний размер пор составлял около 167 мкм. Предостеобласты мыши MC3T3-E1 могли адгезироваться, пролиферировать и демонстрировать изменения, связанные с дифференцировкой, в трехмерной структуре. Это предоставляет метод для создания культивационных каркасов с заданной структурой пор, однако указанный размер пор не является универсальным стандартом для всех типов клеток.4
Удаление части волокон для создания каналов проникновения внутрь
В работе Baker и др. 2012 волокна PCL с замедленной деградацией собирали совместно с растворимыми волокнами полиоксиэтилена (PEO), после чего удаляли PEO. Культивирование клеток, полученных из человеческого мениска, показало, что увеличение доли удаляемых компонентов способствует улучшению внутреннего распределения клеток и матрицы, при этом сохраненные ориентированные волокна продолжают задавать направление. В исследовании также отмечено, что клеточное натяжение может деформировать менее плотные структуры, поэтому для длительного культивирования применялась фиксация по периметру. Результаты in vitro на клетках человека не отражают эффект имплантации у пациентов.5
05Трехмерная форма и стабильность во влажном состоянии: включение образца в реальный процесс культивирования
Gao и др. в 2018 году поместили электроформованные мембраны в печатные формы 3D и с помощью процесса вспенивания сформировали объёмные слоистые каркасы заданной формы, после чего провели оценку клеточной активности in vitro. В исследовании также с помощью биопечати задавалось начальное расположение клеток для наблюдения за их миграцией из гидрогеля в каркас. Это демонстрирует сочетание электроформования, форм и способов размещения клеток, что может послужить основой для разработки конструкций культивирования с заданной формой и пространственным распределением.6
Gu и др. в 2024 году сосредоточились на более повседневной проблеме: усадке волокнистых каркасов PLGA после помещения в среду культивирования. В исследовании в PLGA были введены PCL и фиброин для отдельного изучения размерной стабильности, смачивания, деградации in vitro и пролиферации клеток. Результаты подтверждают возможность улучшения размерной стабильности во влажном состоянии и клеточного отклика за счёт композитных компонентов, что показывает: сохранение формы образца само по себе является частью разработки платформы для культивирования.7
Эти два исследования отвечают разным задачам: в первом случае трехмерная геометрия формируется целенаправленно, во втором — уменьшаются нежелательные деформации в процессе использования. При выборе подходящего варианта следует сначала определить, требуется ли свободное изменение формы, фиксация в культивационном каркасе или соединение с другим каркасом, а затем обсуждать способы сбора и последующей обработки.6,7
06Что именно означает «эффективность» в клеточных экспериментах
Активное окрашивание, оценка метаболизма, подсчёт клеток, глубина проникновения и функциональные маркеры не отвечают на один и тот же вопрос. Увеличение числа клеток может быть полезно для исследований по их пролиферации, однако если целью является сохранение определённого фенотипа, необходимо также проводить морфологическую, экспрессионную или функциональную оценку. При сравнении данных из разных работ следует учитывать источник клеток, плотность посева, время культивирования и контрольные образцы, а не ранжировать материалы исключительно по проценту пролиферации.1,2,3,4,5,6,7
Клеточные линии человека или клетки, полученные из тканей человека, по-прежнему могут использоваться в исследованиях in vitro, однако это не позволяет называть их клиническими испытаниями на людях. Представленные в данной работе данные о материалах и культивировании в основном помогают определить подходящие структуры и экспериментальные переменные; они не доказывают непосредственного формирования имплантируемой ткани и тем более не могут самостоятельно подтверждать восстановление функций органа.2,5,6
07От отдельной экспериментальной мембраны к сопоставимым культивационным образцам
При согласовании требований к изготовлению можно сначала указать тип клеток, цель культивирования и форму образца: диск для размещения в лунке культивирования, ориентированная мембрана, закрепленная в каркасе, сетчатый каркас или трехмерная структура определенной толщины. Затем следует уточнить направление волокон, толщину или поверхностную плотность, эффективную пористость, место отбора образцов и размеры во влажном состоянии, чтобы конфигурация оборудования соответствовала измеряемым параметрам.
В случайных мембранах обычно делают акцент на стабильном обеспечении жидкостью и равномерном сборе; при упорядоченном расположении необходимо контролировать способ сбора и согласованность направления; при ближнем прямом письме — траекторию и межслойное наложение; при поверхностной функционализации или вспененных структурах — включение последующей обработки в протокол партии. В контрольной группе следует изменять только ключевую изучаемую переменную, избегая одновременного изменения состава, толщины мембраны и условий культивирования, что затруднило бы интерпретацию результатов.
Перед проведением полноценных клеточных экспериментов необходимо убедиться, что этапы промывки, удаления остатков, стерилизации или дезинфекции, предварительного смачивания и фиксации не изменяют свойства материала. Изготовление образцов большей площади может упростить серийную нарезку, однако по-прежнему следует сравнивать структуру волокон и клеточный отклик в разных участках и разных партиях. Повторяемость технологического процесса оборудования и повторяемость биологических экспериментов необходимо связать посредством единого протокола регистрации образцов.2,3,4,5,6,7
08Распространённые проблемы в разработке волокнистых мембран для культивирования клеток
Обязательно ли чем тоньше волокна, тем лучше результаты культивирования клеток?
Не обязательно. Тонкие волокна обеспечивают контактную поверхность, но более плотная структура может препятствовать проникновению клеток внутрь. Исследования многомасштабных волокон и прямопечатных сеток показывают, что структуру следует выбирать в зависимости от цели — поверхностного или трёхмерного культивирования.3,4,5
Обязательно ли добавлять коллаген или другие белки непосредственно в раствор для электроформования?
Не обязательно. Смешивание в растворе и последующая модификация поверхности — это два разных подхода. Необходимо учитывать условия обработки белка, его способность к фибриллообразованию, экспозицию на поверхности и стабильность во влажном состоянии, чтобы сравнить, какой подход лучше подходит для планируемого эксперимента.1,2
Можно ли называть обычную электроформованную мембрану трёхмерным каркасом для культивирования?
Следует проверить, проникают ли клетки в толщу материала и формируется ли внутри воспроизводимое распределение и целевое поведение. Толщина каркаса или наличие пор на микрофотографиях сами по себе не дают ответа на эти вопросы.3,4,5,6
Список литературы
Ниже приведены оригинальные исследования, использованные в данной статье, независимо обобщённые компанией TONGLI. Интерпретация литературы не означает наличия у авторов статей, исследовательских учреждений или TONGLI отношений по поставке оборудования или сотрудничества; конкретный охват чтения указан в пояснениях к каждой работе.
Библиографические записи сохранены на языке оригинала для точного поиска.
Wu P, Dai X, Chen K, Li R, Xing Y. Fabrication of regenerated wool keratin/polycaprolactone nanofiber membranes for cell culture. International Journal of Biological Macromolecules. 2018;114:1168–1173.
DOI：10.1016/j.ijbiomac.2018.03.157 ↗Область чтения: оригинальный полный текст локально и сверка с аннотацией и библиографией PubMed
Pérez-Nava A, Espino-Saldaña AE, Pereida-Jaramillo E, et al. Surface collagen functionalization of electrospun poly(vinyl alcohol) scaffold for tissue engineering. Process Biochemistry. 2023;126:1–14.
DOI：10.1016/j.procbio.2022.12.022 ↗Область чтения: оригинальный полный текст локально и сверка с записями о публикациях автора по его организации
Li D, Chen W, Sun B, et al. A comparison of nanoscale and multiscale PCL/gelatin scaffolds prepared by disc-electrospinning. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2016;146:632–641.
DOI：10.1016/j.colsurfb.2016.07.009 ↗Область чтения: оригинальный полный текст локально и сверка с аннотацией и библиографией PubMed
He FL, Li DW, He J, et al. A novel layer-structured scaffold with large pore sizes suitable for 3D cell culture prepared by near-field electrospinning. Materials Science and Engineering C. 2018;86:18–27.
DOI：10.1016/j.msec.2017.12.016 ↗Область чтения: оригинальный полный текст локально и сверка с аннотацией и библиографией PubMed
Baker BM, Shah RP, Silverstein AM, et al. Sacrificial nanofibrous composites provide instruction without impediment and enable functional tissue formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 2012;109:14176–14181.
DOI：10.1073/pnas.1206962109 ↗Область чтения: аннотация и раздел результатов оригинальной статьи PMC; приводимая в данной статье часть, посвящённая культивированию клеток мениска человека in vitro
Gao Q, Gu H, Zhao P, et al. Fabrication of electrospun nanofibrous scaffolds with 3D controllable geometric shapes. Materials & Design. 2018;157:159–169.
DOI：10.1016/j.matdes.2018.07.042 ↗Область чтения: оригинальный полный текст локально и сверка с аннотацией и библиографией журнала
Gu P, Mao Y, Lu W, Chen W. Silk fibroin incorporated electrospun aliphatic polyester nanofiber scaffolds with excellent dimensional stability and cytocompatibility. European Polymer Journal. 2024;211:113039.
DOI：10.1016/j.eurpolymj.2024.113039 ↗Область чтения: оригинальный полный текст локально и сверка с оригинальной аннотацией и выводами журнала
Вышеизложенное содержание основано на анализе и интерпретации общедоступных научных статей. В случае нарушения авторских прав или если первоначальные авторы не желают, чтобы соответствующая информация публиковалась в такой форме, пожалуйста, свяжитесь с нами, и мы немедленно удалим соответствующий материал.