本稿では2012年から2024年までの7件の原著研究を選定し、中国、米国、メキシコの各チームおよび国際共同研究の成果を網羅して叙述的レビューを行う。内容は主に材料とin vitro培養のエビデンスを占める。一部の論文には動物研究も含まれるが、本稿ではヒト由来細胞の実験をヒトにおける有効性として記述しない。
01細胞培養基盤と三次元足場：まず何を観察するかを明確にする
細胞培養材料を開発する際には、まず実験の目的を明確にすべきである。初期接着を向上させたいのか、配列と移動を観察したいのか、それとも細胞を一定の厚さの構造内に取り込ませて基質を沈着させたいのか。これらの目標は、それぞれ異なる孔構造、支持性、表面特性に対応する。通常の平面培養の結果と三次元足場内の細胞分布は分けて評価すべきであり、足場の形状が厚さがあるというだけで三次元培養が実現したと断定することはできない。3,4,5,6
| 培養要件 | 検討可能な繊維構造 | 重点的に観察すべき点 |
|---|---|---|
| 平面培養と材料選定 | ランダム繊維膜、表面修飾膜 | 細胞接着、活性、伸展および標的表現型 1,2 |
| 配向した細胞と基質組織 | 配向繊維、除去可能な成分からなる複合構造 | 配向方向、浸潤および基質分布 5 |
| 三次元細胞培養 | マルチスケール繊維、直接描画メッシュ、膨張性足場 | 内部細胞分布、孔の連結性および形状保持 3,4,6 |
「汎用組織足場」とは、ここでは異なる細胞や実験目的に応じて調整可能な材料プラットフォームを指し、一つの処方がすべての組織に適していることを意味するものではない。研究者は依然として、細胞由来、培養条件、培養期間、および保持または誘導したい機能を説明する必要がある。1,2,3,4,5,6,7
02材料から孔構造まで、エレクトロスピニングで調整可能な変数とは何か
エレクトロスピニングでは、合成ポリマーとタンパク質などの成分を繊維状に成形できるほか、まず骨格を形成してから表面固定や後処理を行うことも可能である。共混は組成だけでなく、溶液の状態、繊維サイズ、濡れ性をも同時に変化させる可能性がある。したがって、二つの処方を比較する際には、構造変化と細胞応答を合わせて分析すべきである。1,2,3,7
構造面では、繊維の太さ、ランダムまたは規則的な配列、異なるスケールの繊維の共存、およびメッシュ層の積層について検討できる。より細い繊維は豊富な接触界面の形成に有利であるが、密な充填は細胞の内部への侵入を制限する可能性がある。足場の設計では、接触面積、空隙、支持性、および細胞挙動の間で、当該プロジェクトに適した組み合わせを見出す必要がある。3,4,5
03細胞接着界面：タンパク質共混とコラーゲンの後修飾
羊毛ケラチンとPCLの共混
Wuら2018年は、羊毛から抽出した再生ケラチンをPCLと共混してエレクトロスピニングを行い、異なる配合比における濡れ性、分解性、および細胞培養性能を比較した。7日間のマウス線維芽細胞実験では、ケラチン含有系で細胞接着と活性が改善されることが示された。これは、天然タンパク質が合成ポリマーの接触界面を調整する成分として機能し得ること、また、繊維形成と支持機能を単独で担う必要がないことを示している。1
当該研究の結果は、特定のケラチン処理方法、PCL系、および細胞モデルに基づいている。原料の由来や抽出プロセスを変更した場合、処方の繊維形成能力と細胞応答は再検証が必要である。「天然由来」という事実だけで、あらゆる用途において良好な適合性があると断定することはできない。1
まずPVA骨格を紡糸し、その後コラーゲンを結合させる
メキシコの研究チームPérez-Navaら2023年の研究では、別のアプローチが採用された。まずポリビニルアルコール（PVA）ナノ繊維を調製し、後続反応によってコラーゲンを表面に固定した。化学的評価、乾燥・湿潤状態での力学特性、およびHEK-293細胞培養を組み合わせた結果、表面機能化後に細胞適合性が改善されることが観察された。これは、生体成分が必ずしも同一の紡糸溶媒と繊維形成プロセスを経る必要はなく、骨格形成後に導入することも可能であることを示している。2
サンプル開発における意義は、「どのように安定した膜を形成するか」と「細胞がどの表面と接触するか」を、それぞれ比較可能な二つの変数に分離できる点にある。後修飾を行う際には、結合度、洗浄後の保持、および湿潤状態での維持も追跡し、溶液中にコラーゲンを添加したという事実のみをもって表面に安定した機能層が形成されたと断定しないようにすべきである。2
04細胞を内部へ：マルチスケール繊維、直接描画、および除去可能な成分
マイクロメートルスケールの繊維が空間を提供し、ナノメートルスケールの繊維が接触を提供する
Liら2016年は、ディスクフリーエレクトロスピニングを用いて、PCL/ゼラチンのナノスケール構造とマイクロ・ナノマルチスケール構造を比較した。マルチスケール足場はより大きな空隙を持ち、マウス線維芽細胞およびラット骨髄間葉系幹細胞の培養において、より良好な増殖と内部への侵入が示された。この研究は、「繊維が均一であるか」と「培養構造が適切であるか」を区別した。すべての用途において、完全に均一な細繊維が求められるわけではない。3
近接場直接描画による孔の位置配置
Heら2018年は、近接場エレクトロスピニングによるメッシュの直接描画と層積重ねによってPCL/ヒドロキシアパタイト足場を構築し、報告された平均孔径は約167マイクロメートルであった。マウス前骨芽細胞MC3T3-E1は、三次元構造内で接着、増殖し、分化に関連する変化を示すことができた。これは、孔の配置を記述可能な培養足場を必要とする場合に有効な方法を提供するが、当該孔径はすべての細胞に通用する標準ではない。4
一部の繊維を除去し、内部への侵入経路を確保する
Bakerら2012年は、分解が遅いPCL繊維と水溶性のポリエチレンオキシド（PEO）繊維を共に集束し、その後PEOを除去した。ヒト半月板由来細胞の培養では、除去可能な成分を増やすことで内部の細胞と基質の分布が改善され、同時に保持された配向繊維が配向の手がかりを提供し続けることが示された。また、細胞の牽引力によって比較的緩い構造が変形する可能性があるため、長期培養では境界固定が採用されたことも報告されている。ヒト細胞を用いたin vitroの結果は、患者への移植効果を意味するものではない。5
05三次元形状と湿潤状態での安定性：サンプルを実際の培養プロセスに組み込む
Gaoら2018年は、エレクトロスピニング膜を3Dで印刷した金型に配置し、発泡プロセスを利用して所定の形状を持つ膨張性の層状足場を形成し、in vitroでの細胞評価を行った。また、バイオプリンティングによって細胞の初期位置を配置し、細胞が水凝胶から足場へ移動する過程を観察した。これは、エレクトロスピニング、金型、および細胞配置方法を組み合わせることで、形状と空間分布の両方が要求される培養設計の着想を得るのに適していることを示している。6
Guら2024年は、より日常的な問題、すなわちPLGA繊維足場が培養環境に入った後の収縮に焦点を当てた。研究では、PCLとフィブロインをPLGAに導入し、それぞれ寸法安定性、濡れ性、in vitro分解性、および細胞増殖を調査した。結果は、複合成分によって湿潤状態での寸法と細胞応答が改善されることを支持しており、サンプルの形状を維持すること自体が培養プラットフォーム開発の一部であることを示している。7
これら二つの研究は、異なるニーズに対応している。前者は三次元形状を能動的に構築し、後者は使用中の予期せぬ変形を低減する。実際の選定では、まず自由な変形が必要か、培養フレーム内に固定するか、あるいは他の骨格と結合させるかを決定し、その上で集束方法と後処理方式を検討すべきである。6,7
06細胞実験における「有効」とは具体的に何を指すか
活性染色、代謝測定、細胞数、内部への侵入深度、および機能マーカーは、同じ問いに答えるものではない。細胞数の増加は増幅研究には有利かもしれないが、特定の表現型を維持することが目的であれば、形態、発現、または機能に関する測定も併せて行うべきである。論文間で比較する際も、単一の増殖率だけで材料の優劣を並べるのではなく、細胞由来、接種量、培養時間、および対照群を総合的に見る必要がある。1,2,3,4,5,6,7
ヒト細胞株やヒト組織由来細胞はin vitro研究に使用可能であるが、それによって人体臨床試験であると称することはできない。本稿で引用された材料と培養結果は、主に研究可能な構造と実験変数を特定するのに役立つものであり、移植可能な組織が形成されたことを直接証明するものではなく、ましてや臓器機能が回復したことを単独で証明するものでもない。2,5,6
07一枚の実験膜から、比較可能な培養サンプルへ
製造要件を伝える際には、まず細胞の種類、培養用途、およびサンプルの形状、すなわち培養ウェルに収める円形ディスク、フレームに固定された配向膜、メッシュ状の足場、あるいは一定の厚さを持つ三次元構造を提示するとよい。さらに、繊維の配向、厚さまたは面密度、有効空隙、サンプリング位置、および湿潤状態での寸法を明確にし、装置の構成を検出可能な目標に適合させるべきである。
ランダムな膜は通常、安定した供給液と均一な回収に重点を置きます。整列配置では回収方法と方向の一貫性に注意する必要があります。近接場直接描画では軌跡と層間積層に注意が必要です。表面機能化や発泡構造では、後処理もバッチ記録に含める必要があります。対照群は、可能な限り研究対象の主要な変数のみを変更し、処方や膜厚、培養条件を同時に変更して結果を解釈できなくなる事態を避けるべきです。
正式な細胞実験の前に、洗浄、残留物、滅菌または消毒、予備潤湿、固定の各工程が材料を変化させていないか確認する必要があります。より大きな面積で作製すればバッチでのサンプリングが容易になりますが、それでも異なる位置や異なるバッチの繊維構造と細胞応答を比較しなければなりません。装置のプロセス再現性と生物学的実験の再現性は、この共通のサンプル記録を通じて結びつける必要があります。2,3,4,5,6,7
08細胞培養用繊維膜の研究開発におけるよくある問題
繊維が細いほど、細胞培養の効果は必ずしも良くなるのでしょうか。
必ずしもそうではありません。細い繊維は接触界面を提供できますが、構造が密すぎると細胞が内部に侵入しにくくなる可能性があります。多スケール繊維と直接描画グリッドに関する研究では、表面培養または三次元培養の目的に応じて構造を選択すべきであることが示唆されています。3,4,5
コラーゲンやその他のタンパク質を必ず紡糸溶液に直接加える必要がありますか。
必ずしもそうではありません。共混と紡糸後の表面修飾は、2つの異なるアプローチです。タンパク質の処理条件、繊維形成能、表面での提示状態、湿潤状態での安定性を総合的に考慮し、いずれのアプローチが計画している実験により適しているかを比較する必要があります。1,2
通常のエレクトロスピニング膜をそのまま三次元培養足場と呼ぶことはできますか。
細胞が厚さ方向に侵入しているか、また内部で再現可能な分布と目的の挙動が形成されているかを観察する必要があります。足場が厚いことや顕微鏡画像に孔が見られることだけでは、これらの問いに独立して答えることはできません。3,4,5,6
参考文献
以下は本稿で使用した原著研究であり、TONGLIが独自にまとめたものである。文献の解釈は、論文の著者、研究機関とTONGLIとの間に装置の購入または協力関係があることを示すものではない。具体的な閲覧範囲は各文献の説明を参照のこと。
検索・照合のため、書誌情報は原著の言語で記載しています。
Wu P, Dai X, Chen K, Li R, Xing Y. Fabrication of regenerated wool keratin/polycaprolactone nanofiber membranes for cell culture. International Journal of Biological Macromolecules. 2018;114:1168–1173.
DOI：10.1016/j.ijbiomac.2018.03.157 ↗閲覧範囲：現地の原文全文、およびPubMedの要約と書誌情報の照合
Pérez-Nava A, Espino-Saldaña AE, Pereida-Jaramillo E, et al. Surface collagen functionalization of electrospun poly(vinyl alcohol) scaffold for tissue engineering. Process Biochemistry. 2023;126:1–14.
DOI：10.1016/j.procbio.2022.12.022 ↗閲覧範囲：現地の原文全文、および著者所属機関の論文記録の照合
Li D, Chen W, Sun B, et al. A comparison of nanoscale and multiscale PCL/gelatin scaffolds prepared by disc-electrospinning. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2016;146:632–641.
DOI：10.1016/j.colsurfb.2016.07.009 ↗閲覧範囲：現地の原文全文、およびPubMedの要約と書誌情報の照合
He FL, Li DW, He J, et al. A novel layer-structured scaffold with large pore sizes suitable for 3D cell culture prepared by near-field electrospinning. Materials Science and Engineering C. 2018;86:18–27.
DOI：10.1016/j.msec.2017.12.016 ↗閲覧範囲：現地の原文全文、およびPubMedの要約と書誌情報の照合
Baker BM, Shah RP, Silverstein AM, et al. Sacrificial nanofibrous composites provide instruction without impediment and enable functional tissue formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 2012;109:14176–14181.
DOI：10.1073/pnas.1206962109 ↗閲覧範囲：PMCの原著論文の要約および結果部分、本文で引用されている半月板由来細胞のin vitro培養部分
Gao Q, Gu H, Zhao P, et al. Fabrication of electrospun nanofibrous scaffolds with 3D controllable geometric shapes. Materials & Design. 2018;157:159–169.
DOI：10.1016/j.matdes.2018.07.042 ↗閲覧範囲：現地の原文全文、および学術誌の要約と書誌情報の照合
Gu P, Mao Y, Lu W, Chen W. Silk fibroin incorporated electrospun aliphatic polyester nanofiber scaffolds with excellent dimensional stability and cytocompatibility. European Polymer Journal. 2024;211:113039.
DOI：10.1016/j.eurpolymj.2024.113039 ↗閲覧範囲：現地の原文全文、および学術誌の原著要約と結論の照合
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